Цифровая ПЦР
Концепция цифровой ПЦР была впервые описана в 1992 г. Именно тогда, исследователи пришли к выводу, что сочетания предельных разведений, ПЦР с детекцией по "конечной точке" и статистики Пуассона может позволить измерить абсолютную концентрацию нуклеиновых кислот Впоследствии они разработали метод, с помощью которого образец разбавляют до такой степени, что отдельные молекулы матрицы могут быть амплифицированы индивидуально, каждая в отдельной ячейке, а продукты реакции обнаруживаются с помощью флуоресцентных зондов.
Этот метод в итоге и был обозначен термином «цифровая ПЦР».
Этот метод в итоге и был обозначен термином «цифровая ПЦР».
Цифровая ПЦР (digital PCR ) — это метод, с помощью которого количество ДНК можно определить точнее, чем используя ПЦР в реальном времени. Например, цифровую ПЦР используют, чтобы обнаружить однонуклеотидные мутации в популяции последовательностей дикого типа. В случае традиционной ПЦР, реакция будет происходить во всём объёме пробы, и сигнал от последовательностей дикого типа может доминировать и скрывать сигналы от редких последовательностей. В случае цифровой ПРЦ, пробу делят на множество отдельных компартментов, в каждом из которых ПЦР проводят отдельно. Это позволяет свести к минимуму эффекты конкуренции между мишенями и позволяет проводить чувствительный и точный абсолютный количественный анализ нуклеиновых кислот.
Методы разделения на компартменты в различных технологиях цифровой ПЦР отличаются друг от друга (используют масляную эмульсию, капилляры и т.д.), а реакцию проводят в планшетах с микролунками.
Результаты визуализируют чаще всего с помощью системы TaqMan, но иногда применяют и интеркалирующие агенты, например, зеленую флуоресцирующую краску EvaGreen.
Методы разделения на компартменты в различных технологиях цифровой ПЦР отличаются друг от друга (используют масляную эмульсию, капилляры и т.д.), а реакцию проводят в планшетах с микролунками.
Результаты визуализируют чаще всего с помощью системы TaqMan, но иногда применяют и интеркалирующие агенты, например, зеленую флуоресцирующую краску EvaGreen.
Критический шаг в цифровой ПЦР – это разделение образца на дискретные субъединицы перед амплификацией. Начальные этапы пробоподготовки аналогичны тем, которые необходимы для ПЦР в реальном времени, но после этого образцы разводятся в десятки тысяч раз, и помещаются в тысячи отсеков, каждый из которых в идеале содержит либо ноль, либо одну (или, самое большее, несколько) молекул ДНК. В каждом отсеке идёт своя отдельная реакция ПЦР, и, как и в случае ПЦР в реальном времени, флуоресцентные зонды используются для идентификации амплифицированной целевой ДНК.
Метод цПЦР разработали австралийцы Алек Морли и Памела Сайкс в 1992 году, когда исследовали больных лейкемией. В последующие годы разные исследовательские группы разрабатывали свои варианты, в том числе и варианты компартментализации. К сожалению, все они имели существенный недостаток — высокую трудоемкость: пробу надо было разделять на сотни (а то и тысячи) реакций объемом по нескольку микролитров каждая или проводить дополнительные реакции (например, иммобилизацию праймеров на магнитных шариках и гибридизацию продуктов ПЦР с флуоресцентными пробами), а затем отдельно анализировать результаты.
От этих проблем экспериментаторов избавила капельная цифровая ПЦР (кцПЦР), или по-английски droplet digital PCR (ddPCR).
Но осталось ещё одно неудобство: количество ДНК в образце можно было определить только в конечной точке. Технология с использованием картриджей, реализованная в анализаторе LOAA (On-Point), позволяет реализовать цифровую ПЦР с детекцией ДНК в реальном времени
Но осталось ещё одно неудобство: количество ДНК в образце можно было определить только в конечной точке. Технология с использованием картриджей, реализованная в анализаторе LOAA (On-Point), позволяет реализовать цифровую ПЦР с детекцией ДНК в реальном времени
Как выбрать между real-time PCR и цифровой PCR?
ПЦР в реальном времени или количественная ПЦР – это хорошо зарекомендовавшая себя технология, которая стала предпочтительным инструментом для быстрого и точного количественного определения нуклеиновых кислот в различных биологических образцах.
Цифровая ПЦР – это высокоточный подход к чувствительному обнаружению и количественному определению нуклеиновых кислот и его имеет смысл использовать для более тонких задач.
В таблице указывается уровень пригодности каждой технологии для некоторых распространенных способов использования.
Follow Us
It is the intended result of the entire process of presenting textual material to convey meaning so that others would easily grasp it.
Photo credits: Nicola Albertini
All photo and video materials belong to their owners and are used for demonstration purposes only. Please do not use them in commercial projects.
All photo and video materials belong to their owners and are used for demonstration purposes only. Please do not use them in commercial projects.
